Estudio del impacto de la expresión de la P5B-ATPasa 13A2 sobre la infección del virus Chikunguña en células SH-SY5Y

Abstract

Las ATPasas de tipo P pertenecen a una superfamilia de proteínas que transportan cationes inorgánicos y otros sustratos a través de las membranas celulares. Utilizan la hidrólisis de ATP para realizar el transporte del sustrato y se caracterizan por la formación de un intermediario fosforilado durante su ciclo de reacción. Por similitud de secuencia se han dividido en cinco subfamilias denominadas tipo I-V o P1-P5. La subfamilia de P5-ATPasas se expresa únicamente en eucariotas y se divide en dos grupos denominados P5A y P5B; la ATP13A1 pertenece al grupo de las P5A, mientras que las ATP13A2-5 se agrupan dentro del grupo de las P5B. Las P5A-ATPasas se encuentran en el retículo endoplásmico y afectan la maduración y secreción de proteínas, mientras que las P5BATPasas se localizan en endosomas tardíos (conocidos también como cuerpos multivesiculares, MVBs) y lisosomas y están implicadas en el correcto funcionamiento del sistema endolisosomal. Se ha demostrado que las P5B-ATPasas, como la P5B-ATPasa 13A2 (ATP13A2), exportan poliaminas como la espermidina desde el interior de los MVBs y lisosomas hacia el citosol. En este sentido, resultados obtenidos en nuestro laboratorio mostraron que la ATP13A2 provoca un aumento en la capacidad de almacenamiento de la poliamina natural espermidina y altera la homeostasis lipídica de manera consistente con la exocitosis del sistema endolisosomal. Inicialmente, la disfunción de las P5B-ATPasas ha sido vinculada a varias neuropatologías. Mutaciones que causan la pérdida de función del gen humano ATP13A2 subyace una forma de aparición temprana de Parkinson denominada Síndrome de Kufor Rakeb (KRS), así como un tipo de Lipofusinosis Ceroidea Neuronal (NCL), Paraplegia Espástica Hereditaria y Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA). Sin embargo, recientemente se encontró que la expresión de la ATP13A2 está aumentada en pacientes con cáncer colorrectal y cervical, mientras que la ATP13A3 está incrementada en cáncer de páncreas. Estos hallazgos amplían el abanico de enfermedades en las que esta subfamilia de P5B-ATPasas está involucrada y demuestra que tanto la ausencia como la sobreexpresión de estas proteínas afectan profundamente la homeostasis celular, lo cual sugiere que podrían afectar el desarrollo de otras patologías hasta ahora inexploradas. Una vasta evidencia indica que la regulación del metabolismo de lípidos ejercida por los virus tiene un rol importante en su ciclo de replicación e impacta en la infección. Además, muchos virus requieren poliaminas para uno o varios pasos de su ciclo de replicación como la polimerización del ADN y ARN, empaquetamiento de los ácidos nucleicos y síntesis proteica. Asimismo, muchos virus con envoltura dependen del tráfico endolisosomal de la célula huésped para ingresar a las células e iniciar su ciclo de infección. Con este propósito, el objetivo de este trabajo fue evaluar el impacto de la expresión de la ATP13A2 sobre la infección del virus Chikunguña (CHIKV) en células derivadas de un neuroblastoma humano denominadas SH-SY5Y. Con el propósito de obtener clones de células con el gen ATP13A2 inactivado mediante el sistema CRISPR-Cas9, inicialmente se generó un plásmido que codifica el ARN guía dirigido al gen ATP13A2, junto con la nucleasa Cas9, con el cual se transfectaron las células SH-SY5Y. Algunos clones mostraron una menor tasa de división celular respecto de las células SH-SY5Y salvajes, lo cual es esperable dado que las poliaminas estimulan la proliferación celular. A continuación, se seleccionó uno de los clones con menor tasa de división y se utilizó junto con un clon de células que sobreexpresan la ATP13A2 activa, así como una versión mutante inactiva de esta proteína, generados previamente en nuestro laboratorio. Con estas líneas celulares se evaluó la replicación viral del CHIKV mediante titulación por ensayo de unidades formadoras de placas (UFP). A partir de esta estimación se pudo observar que, si bien las diferencias no son significativas, la línea celular que no expresaría la ATP13A2, mostró un título viral menor que el de las células control o que sobreexpresan la ATPasa.